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Dorianna Sandonà studia da anni le sarcoglicanopatie. Vincitrice di numerosi bandi di ricerca Telethon e non solo, è professoressa associata di Biologia Molecolare presso l’Università degli Studi di Padova. Nell’ambito di queste malattie si occupa dello sviluppo di potenziali terapie e di modelli animali in cui sperimentarle.


Dunque professoressa, iniziamo dalle basi: qual è il suo argomento di ricerca?

La mia ricerca riguarda le malattie rare, e in particolare la definizione dei loro meccanismi patogenetici, cioè capire come il difetto genetico effettivamente si manifesti nel fenotipo malato. E ovviamente capire come si può cercare di correggere questo difetto usando piccole molecole, non necessariamente con la terapia genica.

Quindi è la base per la ricerca di una cura?

Esatto, prima capiamo cosa succede nelle cellule delle persone che hanno una determinata malattia, e poi una volta capito questo, indaghiamo se si può intervenire con inibitori o altre piccole molecole, cercando di recuperare il fenotipo sano o quantomeno migliore la condizione del paziente.

Di che malattie si occupa in particolare?

Lavoro da parecchi anni sulla sarcoglicanopatia, che è una malattia genetica autosomica recessiva, ovvero che colpisce egualmente maschi e femmine, e i cui malati sono figli di genitori portatori sani.
È una malattia molto debilitate, i cui sintomi cominciano a manifestarsi nella prima infanzia con un certo ritardo nello sviluppo, proseguendo poi con una sempre maggiore debolezza muscolare. I muscoli che sono interessati prevalentemente sono quelli prossimali dell’anca e della spalla, e molto spesso già nell’adolescenza i malati hanno bisogno della sedia a rotelle. Progredendo la malattia, si aggiungono problemi respiratori in quanto viene colpito anche il diaframma, e in alcuni casi anche il cuore, con cardiomiopatie dilatative.
In realtà le sarcoglicanopatie sono quattro perché possono essere dovute a mutazioni in 4 geni: quelli codificanti il sarcoglicano alfa, beta, gamma e delta.

E cosa fanno questi 4 geni?

Questi 4 geni codificano 4 proteine che formano un complesso sulla membrana delle cellule del muscolo striato, quindi i muscoli scheletrici e il cuore.
Questo complesso è poi associato alle altre proteine che formano il grande complesso di proteine associate alla distrofina, che ha un ruolo strutturale molto importante perché connette le proteine contrattili dentro la fibra muscolare con quelle della matrice extracellulare, facendo da ponte. Non solo serve a trasferire le forze derivanti dalla contrazione muscolare, ma anche a proteggere la membrana dagli stress della contrazione stessa, che potrebbero lesionarla.

Nelle sarcoglicanopatie infatti il complesso delle proteine associate alla distrofina non è ben assemblato perché mancano o sono fortemente ridotti i sarcoglicani, e come conseguenza c’è un danno a livello della membrana che può innescare processi di degenerazione del muscolo. Questo vale anche per la distrofia muscolare di Duchenne, e tutte le altre malattie legate a geni codificanti proteine di questo complesso.

Le mutazioni di che tipo sono di solito?

Alcune sono mutazioni che portano all’assenza totale della proteina perché sono nel promotore o nei siti di splicing. Poi ci sono quelle che portano alla generazione di codoni di stop prematuri, originando una proteina tronca.

Nelle sarcoglicanopatie però la maggior parte delle mutazioni, fino al 60%, sono mutazioni missenso in cui cambia un singolo amminoacido della proteina. Per capire quindi come “funziona” la malattia, abbiamo visto cosa succedeva alla proteina con queste mutazioni e quello che abbiamo scoperto è che la cellula la elimina poiché il suo sistema di controllo qualità la riconosce come difettiva nel folding e la invia alla degradazione, tramite il sistema ubiquitina-proteasoma.

E quindi il problema è che la cellula è troppo perfezionista?

Esatto, la proteina magari funzionerebbe comunque anche se un po’ peggio del normale, ma le cellule degli individui malati invece tendono a distruggerla. La malattia è infatti piuttosto eterogenea tra i malati, e ciò dipende da quanta proteina riesce a sopravvivere ai sistemi di controllo della cellula e ad arrivare sulla membrana.
Ciò può dipendere dalle diverse mutazioni presenti, nel senso che alcune causano dei problemi di folding più gravi favorendo l’eliminazione totale del sarcoglicano, mentre con altre il problema è minore e alcune forme mutate riescono comunque a raggiungere la membrana.

E ciò correla con la gravità della malattia?

In generale sì, ma esistono delle eccezioni. Addirittura in fratelli, la stessa mutazione può avere effetti diversi, per cui uno è costretto alla sedia a rotelle precocemente mentre l’altro mantiene la deambulazione più a lungo. Ciò è molto interessante perché si ritiene sia la conseguenza del diverso background genetico delle persone, in cui altri geni in qualche modo “compensano”. Per esempio, si può ipotizzare che il sistema che degrada le proteine sia un po’ meno efficiente negli individui meno colpiti, perché si lascia sfuggire alcune proteine che riescono a raggiungere la membrana e svolgere comunque, anche se parzialmente, la loro funzione.

E come siete arrivati a lavorare su questo argomento?

Anni fa ormai, studiavamo l’alfa-sarcoglicano perché avevamo individuato una sua possibile azione enzimatica. Ovvero nella porzione extracellulare era stato individuato per omologia un sito di legame per l’ATP.

L’idea successiva è stata quella di verificare effettivamente l’attività enzimatica. Abbiamo quindi espresso l’alfa sarcoglicano in un modello cellulare e messo in piedi un saggio enzimatico in cui aggiungendo l’ATP all’esterno delle cellule misuravamo la sua riduzione (veniva degradato). Certo, con una Km micromolare, ma poteva funzionare.

Successivamente abbiamo cercato di collegare queste scoperte con la malattia, abbiamo analizzato le diverse mutazioni e ne abbiamo trovata una in particolare che colpiva proprio quel sito (di legame dell’ATP). Abbiamo pensato di vedere che differenze ci fossero nell’utilizzo dell’ATP tra la proteina wild-type e quella mutata per capire se fosse ancora in grado di degradare l’ATP oppure no.

Così abbiamo espresso la proteina mutante, e il primo risultato che abbiamo ottenuto è stato che la proteina mutante in realtà non veniva quasi espressa, e ci siamo chiesti perché a parità di condizioni succedesse ciò. Abbiamo rifatto l’esperimento più volte, ottenendo sempre lo stesso risultato. E quindi abbiamo iniziato a indagare il motivo di questo risultato. I livelli di mRNA erano uguali, e quindi voleva dire che succedeva qualcosa di post-trascrizionale.

Studiando la letteratura ci siamo resi conto che diverse proteine si comportavano così, e abbiamo cominciato a chiederci se la degradazione della proteina avvenisse tramite il sistema ubiquitina-proteasoma o l’autofagia. Provando a bloccare il proteasoma, abbiamo scoperto che i livelli della proteina mutata aumentavano, e abbiamo cominciato a dissezionare il pathway degradativo, anche per individuare bersagli per una potenziale terapia.

E il suo laboratorio, occupandosi di malattie rare, riceve fondi anche dalla Fondazione Telethon per esempio?

Sì, e devo ringraziare la Fondazione Telethon non solo per finanziamenti, che sono il risultato della partecipazione a bandi competitivi, ma anche per il supporto pratico, garantendoci ad esempio l’accesso alle loro banche dati e di materiale biologici come le cellule donate dai pazienti.

Da quanti anni vi finanzia Telethon?

La storia è un po’ lunga.

Come delle sarcoglicanopatie, anche in alcune forme di fibrosi cistica il problema non è tanto il malfunzionamento della proteina mutata, ma piuttosto come questa venga subito degradata dalla cellula in quanto non correttamente ripiegata. Chiesi così all’associazione Americana per la Lotta alla Fibrosi Cistica di mandarmi un’aliquota di alcune molecole usate nel trattamento di questa malattia, e loro furono veramente eccezionali, perché me le mandarono subito nonostante non lavorassi sulla fibrosi cistica. Cominciammo subito a lavorare in alcuni modelli cellulari di sarcoglicanopatia, e osservammo che in alcuni funzionavano.

Così è partita l’idea di applicare ad un bando esplorativo Telethon, della durata di un anno con budget limitato. Coi risultati ottenuti abbiamo poi potuto fare richiesta per un Telethon regolare, che è durato 3 anni e mezzo, e che ci ha dato la possibilità di passare dalle cellule modello a quelle dei pazienti.

Telethon infatti ha delle biobanche in cui sono raccolte le cellule dei pazienti derivate ad esempio da biopsie, e sono messe a disposizione dei ricercatori. Da queste cellule siamo riusciti ad ottenere dei mioblasti, che proliferano, e che poi siamo riusciti a differenziare in un primordio di muscolo in cui si formano i miotubi. Trattando questi miotubi con le piccole molecole abbiamo potuto vedere che recuperavamo il sarcoglicano mutato, sia in termini di quantità che in termini di posizionamento sulla membrana.

Abbiamo poi avuto anche altri finanziamenti, tra cui il così detto “Telethon francese”, che si chiama AFM (Associazione Francese contro le Miopatie) e un altro dalla Muscular Dystrophy Association (MDA), che un po’ l’equivalente americano. Ovviamente tutti questi finanziamenti erano basati sui nostri precedenti studi sulle piccole molecole ed erano anche finalizzati allo sviluppo di modelli animali in cui studiare gli effetti di queste molecole, che è stato uno degli altri grossi problemi che abbiamo avuto.

Quindi da una prima sperimentazione in vitro era necessario poi passare alla sperimentazione animale?

Esatto, perché il modello animale è quello in cui verifichiamo se il cambiamento biochimico che osserviamo in vitro si traduce effettivamente in un effetto funzionale, ovvero se la malattia viene effettivamente curata. E così sia Telethon che MDA ci hanno finanziato per generare nuovi modelli. Telethon per dei topini, mentre MDA per dei pesci, lo zebrafish.

I modelli di topo che abbiamo generato non sono proprio convenzionali, perché abbiamo sfruttato topi knock-out per l’alfa sarcoglicano nei quali con un vettore virale adeno-associato abbiamo introdotto nei muscoli delle zampe posteriori il gene umano (del sarcoglicano) con o senza mutazione. Abbiamo cioè generato dei topini cosiddetti “umanizzati”. Trattando poi i topi che avevano ricevuto il gene mutato con le nostre piccole molecole abbiamo visto risultati molto promettenti in cui si ripristinava la forza muscolare.

E perché la sperimentazione animale è indispensabile nel vostro campo?

Perché prima di passare alla sperimentazione clinica sugli esseri umani, oltre che sull’efficacia, c’è bisogno di raccogliere tutta una serie di dati su tossicità e farmacocinetica che sarebbe troppo rischioso valutare direttamente sull’uomo, nonché eticamente inaccettabile. La sperimentazione animale si potrebbe saltare solo nel caso in cui stessimo parlando di molecole già approvate per altre malattie, e quindi farmaci per cui questi studi fossero già stati fatti. Noi al momento siamo in questa fase animale appunto perché stiamo usando molecole leggermente diverse, e stiamo quindi dimostrando la sicurezza e le premesse funzionali per procedere con un trial clinico.

In cosa si distinguono i finanziamenti che ricevete dalle varie associazioni?

Il finanziamento americano è rivolto a trovare un animale modello alternativo al topo, che sia più versatile dal punto di vista scientifico per eseguire screening su larga scala di nuove molecole terapeutiche, cosa che sarebbe eticamente inaccettabile in topo. Per questo noi abbiamo iniziato a lavorare con lo zebrafish, perché si può intervenire con i test farmacologici già nella fase embrionale. Visto che ogni evento riproduttivo genera 50-150 embrioni puoi testare molte più molecole contemporaneamente e in modo più semplice e veloce.

L’ultimo finanziamento francese invece riguarda lo studio del preciso meccanismo d’azione delle molecole, perché va bene, magari funzionano, ma è importante sapere come. La domanda quindi è: le molecole che stiamo testando agiscono direttamente sul sarcoglicano mutato aiutandolo a ripiegarsi correttamente oppure indirettamente su altre proteine cellulari che aiutano il sarcoglicano a ripiegarsi e/o a raggiungere la membrana dove può poi fare la sua funzione?

Questo è importante da sapere anche per capire se lo stesso farmaco può essere usato per trattare mutazioni diverse della stessa proteina ma anche proteine diverse.

E questo è per quanto riguarda la ricerca, ma lei insegna anche. Come concilia queste due attività?

Questa è una bellissima domanda. Stanno assieme, ma a volte in confitto. Ci sono dei momenti in cui il tempo dedicato alla didattica ti toglie tempo alla ricerca, e ci sono delle volte in cui sembro veramente schizzata perché non riesco a star dietro a tutte le cose.

D’altro canto, credo che fare didattica a fianco alla ricerca sia molto importante per quello che puoi trasmettere ai ragazzi, perché non gli racconti solo quello che puoi leggere sui libri, ma anche letteralmente quello che fai in laboratorio.

Viceversa, c’è un ritorno nella ricerca perché nel laboratorio reclutiamo molti ragazzi che incontro a lezione, che poi vengono a fare la tesi, e magari anche il dottorato.
Alcune delle persone che lavorano con me in questo momento sono arrivate qui proprio così.

Nei corsi universitari spesso ci sono anche attività laboratoriali. Secondo lei ha senso che un professore inserisca nei laboratori didattici attività che potrebbe poi sfruttare per la sua ricerca?

Io credo di sì. È ovvio che nei laboratori didattici possono succedere mille cose, però penso che sia utile perché si immerge lo studente in un problema reale, non solo un puro esercizio accademico per scrivere una relazione.

Dal mio punto di vista poi è anche importante far pensare allo studente come fare gli esperimenti, disegnare la strategia. Ad esempio, se c’è da fare la mutagenesi di una proteina, perché non fargli pensare a come potrebbe farla?

La parte della progettazione è una cosa che sto sperimentando sempre di più nei miei corsi di Advanced Molecular Biology e Protein Engeneering, anche a causa delle restrizioni dovute al COVID. Ho dovuto trasformare una parte dell’attività di laboratorio in attività di disegno sperimentale, ma credo sia stato molto utile e forse anche apprezzato dagli studenti.

Rispetto a quando invece era lei una studentessa, come crede che sia cambiata l’università?

Quando l’ho fatta io, nella seconda metà degli anni ’80, i laboratori erano veramente pochi, ma quei pochi che abbiamo fatto li ricordo ancora con grande entusiasmo. Non mi ricordo in quale corso sia successo, ma abbiamo fatto la dissezione di un lombrico e di una rana, io ero entusiasta di vedere come erano fatti dentro, ma ricordo anche che un mio compagno di corso è proprio andato giù lungo quando abbiamo aperto la rana! Adesso ci sono molti più laboratori.

La tesi come funzionava?

Durava un anno o più, e la scelta del laboratorio era una cosa essenziale, non c’erano Erasmus o cose simili al tempo. I laboratori più quotati avevano una lista d’attesa di anni, e anche io ho iniziato la tesi con un certo ritardo per farla nel laboratorio che avevo scelto. Poi però quando mi sono laureata a dicembre: a novembre era già stato pubblicato il mio lavoro di laurea, e col mio nome tra gli autori!

E su cos’era?

Sulla tossina della difterite. Avevamo cercato di capire il meccanismo d’ingresso della tossina nelle cellule. È stato un bel lavoro.

Secondo lei cosa c’è di diverso tra gli studenti a cui insegna rispetto a quelli con cui ha studiato?

Io credo che ci sia una certa differenza. Alcune cose positive e altre negative. Quando ho studiato io, il dottorato, ed erano i primi anni che c’era in Italia, si faceva davvero perché uno era motivato. Quando ho fatto l’esame di dottorato io c’erano tre posti per 60 candidati. Adesso ci sono molte più posizioni e a sceglierlo in maniera veramente convinta sono sempre meno persone.

Il dottorato ora viene visto, e probabilmente è anche giusto, come una cosa naturale, un secondo step nella tua preparazione, però a volte si rischia di reclutare persone non così motivate ad entrare nel mondo della ricerca. La mia prima borsa di dottorato era di 800 mila lire al mese, non che adesso sia tanto di più perché saranno 1100 euro, però ci sono più possibilità di entrare.

E secondo lei questo scegliere il dottorato come una naturale prosecuzione è anche un po’ per una mancanza di alternative lavorative?

Ai tempi nostri era anche peggio lavorativamente parlando. Fuori dall’università non c’era niente, ora ci sono piccole aziende biotech ad esempio.

Rispetto all’estero però sull’industria biotecnologica restiamo ancora indietro, fuori dall’Italia il dottorato non viene visto come la norma.

Questo noi lo scontiamo e ce lo porteremo dietro ancora per non so quanti decenni, in Italia dico. Quindi ci sono meno possibilità e questo è vero.

Un’altra cosa che a me dispiace tantissimo quando guardo cosa succede nei nostri corsi, è che noi prepariamo dei bravissimi laureati, che poi ci vengono “rubati”. Giustamente, perché dal punto di vista del laureato io capisco perfettamente che tra scegliere di stare in Italia per vivere con le briciole e di andare all’estero dove uno ha più possibilità anche di cambiare più facilmente, è ovvio che uno va all’estero.

Dal punto di vista del paese Italia è una perdita netta, perché non c’è un flusso contrario. Sono pochissimi quelli che dall’estero vengono in Italia; c’è qualche rientro di cervelli, ma solo con grande sforzo. È un progressivo impoverimento del mondo della ricerca italiana per mancanza di fondi.

Io dal MUR, il Ministero della Ricerca, non ho mai ricevuto niente. Tutti i miei finanziamenti li ho ricevuti da associazioni private. Certo il mio settore è molto piccolo, perché studio una malattia rara tra le malattie rare…

Beh, però la ricerca che fa sui nuovi modelli animali è molto utile anche per lo studio di un sacco di altre malattie.

No, no certo, può essere trasversale a qualsiasi patologia muscolare. A volte mi dico: “ma perché ce li facciamo tutti scappare”. Per quello quei pochi bravi che rimangono dobbiamo tenerceli stretti.

Come mai lei ha scelto la carriera accademica dopo la laurea?

Finita la tesi ho cominciato a lavorare con un giovane ricercatore, che adesso è il Rettore, ma che all’epoca era appena tornato dagli Stati Uniti. Là aveva imparato un sacco di cose di biologia molecolare, e aveva deciso assieme a un professore di Padova di mettere in piedi un laboratorio di biologia molecolare, e mi chiesero se avessi voglia di unirmi.
Io ero nella fase dopo la laurea, prima di fare qualsiasi altra cosa e volevo lavorare con loro.

E mi sono subito entusiasmata, perché era una cosa nuova. La biologia molecolare poi è una cosa molto concreta ed il risultato è chiaro subito: o è bianco o è nero. E quindi, quando a luglio mi proposero di concorrere per il dottorato, accettai subito.

Tra tutti gli argomenti che ha studiato, ce n’è uno che le sembrava impossibile che le persone attorno a lei non conoscessero?

Succedeva di più una volta, ora meno. Ti ricordi quando ti dicevo che studiavo l’ATP che si legava al sarcoglicano fuori dalle cellule? Succedeva sempre all’epoca che i miei colleghi rimanessero sorpresi dall’idea dell’ATP all’esterno della cellula. Effettivamente l’ATP è la moneta energetica della cellula, e quindi uno si aspetta di trovarlo solo dentro. Invece l’ATP extracellulare è diventato sempre più un messaggero importantissimo.

Se una cellula si rompe ne rilascia un sacco, segnalando il danno. Su tutte le nostre cellule poi c’è una pletora di recettori dell’ATP e di enzimi che lo degradano. Soprattutto nel sistema immunitario e nel cancro ha un ruolo fondamentale, ma fino a qualche anno fa era poco compreso. Anzi, ricordo degli amici che lavoravano sul calcio come messaggero cellulare, e spesso usavano l’ATP per aumentarne i livelli intracellulari, ma non erano particolarmente interessati a capire come effettivamente ciò avvenisse.

Se lei potesse tornare indietro all’università, qual è un consiglio che si darebbe?

È una domanda che mi sono posta spesso. Io sono biologa, ma per il mio argomento di ricerca una formazione medica mi avrebbe aiutato. D’altro canto, sono anche consapevole che se avessi fatto Medicina non sarei qua, perché alla fine quasi sicuramente sarei andata a fare il medico. Col senno di poi quindi mi dico che è stato meglio così.

Il consiglio che mi darei quindi sarebbe quello di non dubitare delle scelte fatte, di credere nei miei sogni e nei miei desideri. Questo lo dico sempre anche agli studenti o ai miei giovani collaboratori: se una cosa ti piace davvero, lotta veramente e sii pronto a fare sacrifici. Io il primo stipendio vero l’ho preso a 30 anni, prima erano solo borse di ricerca.

Ora l’intervista è finita, si va al bar. Cosa ordina?

Allora, onestamente, più che uno spritz mi prenderei un bianco fermo. Anzi, ti dirò di più: un Vespaiolo o un Vermentino.


Riccardo Spanu, membro e fondatore di Biologi per la Scienza, laureato in Pharmaceutical Biotechnologies (UniPD).

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